AÇÃO DE METALOPROTEASES EM MELANOMA B16F10 EXPOSTO À FRAÇÃO P1G10 DE VASCONCELLEA CUNDINAMARCENSIS

ACTION OF METALLOPROTEASES IN B16F10 MELANOMA EXPOSED TO THE P1G10 FRACTION OF VASCONCELLEA CUNDINAMARCENSIS

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Informações Básicas

• Revista Qualyacademics v.2, n.6

• ISSN: 2965976-0

• Tipo de Licença: Creative Commons, com atribuição e direitos não comerciais (BY, NC).

• Recebido em: 25/12/2024

• Aceito em: 27/12/2024

• Revisado em: 28/12/2024

• Processado em: 29/12/2024

• Publicado em: 03/01/2025

• Categoria: Estudo de Revisão

Como citar esse material:

MOURA, Matheus Henrique de Sousa; DITTZ JÚNIOR, Dalton. Ação de metaloproteases em melanoma B16F10 exposto à fração P1G10 de Vasconcellea Cundinamarcensis. Revista QUALYACADEMICS. Editora UNISV; v.2, n.6, 2024; p. 299-311. ISSN 2965976-0 | D.O.I.: doi.org/10.59283/unisv.v2n6.022

Autores:

Matheus Henrique de Sousa Moura

Médico pela Universidade Federal do Piauí - UFPI. - Contato: math.moura1408@gmail.com

Dalton Dittz Júnior

Mestre, Doutor e Pós-Doutorado em Fisiologia e Farmacologia pela UFMG. Bacharel em Farmácia pela UFMG. – Contato: dittzdalton@gmail.com 

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RESUMO

O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos das proteases de Vasconcellea cundinamarcensis (P1G10) sobre as etapas da metástase, particularmente no processo de invasão celular, em células de melanoma murino B16F10, por meio da determinação da atividade de metaloproteases. O interesse nesse estudo se justifica pela relevância das metástases como fatores prognósticos em pacientes com melanoma, e pela necessidade de desenvolver novas terapias que possam interromper esse processo e melhorar os desfechos clínicos. Estudos anteriores indicaram efeitos antitumorais e antimetastáticos de P1G10 em modelos murinos, porém os mecanismos envolvidos ainda não estão completamente esclarecidos. Para a realização do estudo, células B16F10 foram cultivadas em meio contendo soro bovino fetal (FBS) nas concentrações de 0,1% ou 10%, e tratadas com P1G10 nas concentrações de 0,1 µg/mL ou 1 µg/mL. Após 24, 48 e 72 horas de tratamento, as células foram lisadas e a atividade gelatinolítica foi determinada por zimografia em gel de poliacrilamida. A análise quantitativa foi feita com base na intensidade das áreas de degradação observadas. Os resultados mostraram que o tratamento com P1G10 reduziu significativamente a degradação da gelatina, com uma diminuição de 60% após 24 horas e 75% após 48 horas para a concentração de 1 μg/mL, em comparação com o controle. Para a concentração de 0,1 μg/mL, a redução foi de cerca de 70% após 24 horas, 10% após 48 horas e 10% após 72 horas. A conclusão do estudo sugere que a redução da atividade de metaloproteases intracelulares induzida por P1G10 pode ser um mecanismo importante para o efeito antimetastático observado, corroborando os efeitos antitumorais previamente descritos em modelos murinos de melanoma.

Palavras-chave: Melanoma; Metástase; Protease; Atividade Antiproteolítica.

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the effects of Vasconcellea cundinamarcensis (P1G10) proteases on the stages of metastasis, particularly in the cellular invasion process, in murine melanoma B16F10 cells, by determining the activity of metalloproteinases. The importance of this study lies in the relevance of metastasis as a prognostic factor in melanoma patients and the need for developing new therapies that can interrupt this process and improve clinical outcomes. Previous studies have indicated antitumor and antimetastatic effects of P1G10 in murine models; however, the underlying mechanisms remain not fully understood. For this study, B16F10 cells were cultured in media containing 0.1% or 10% fetal bovine serum (FBS) and treated with P1G10 at concentrations of 0.1 µg/mL or 1 µg/mL. After 24, 48, and 72 hours of treatment, the cells were lysed, and gelatinolytic activity was determined by zymography on polyacrylamide gels. Quantitative analysis was based on the intensity of degradation areas observed. The results showed that treatment with P1G10 significantly reduced gelatin degradation, with a 60% reduction after 24 hours and a 75% reduction after 48 hours at a concentration of 1 μg/mL compared to the control. For the 0.1 μg/mL concentration, the reduction was approximately 70% after 24 hours, 10% after 48 hours, and 10% after 72 hours. The study concludes that the reduction in intracellular metalloproteinase activity induced by P1G10 may be an important mechanism for the observed antimetastatic effect, supporting the antitumor effects previously described in murine melanoma models.

Keywords: Melanoma; Metastasis; Protease; Antiproteolytic Activity..

1. INTRODUÇÃO

As neoplasias são um grupo de doenças que tem como ponto em comum a proliferação celular desregulada de um ou mais tipos de células, sendo classificadas em benignas e malignas. As neoplasias malignas, também chamadas genericamente de câncer, são caracterizadas principalmente pela capacidade de invadir outros tecidos e se disseminar para locais distantes do sítio original, processo conhecido como metástase (INCA, 2020; WHO, 2021).

Embora os avanços na área de medicina diagnóstica estejam desenvolvendo os procedimentos de triagem, a descoberta precoce da doença ainda é exceção. A doença é muitas vezes descoberta já no estágio avançado de metástase, para o qual se há poucas opções terapêuticas que modifiquem a história natural da doença. As metástases, portanto, são os principais fatores de prognóstico dos cânceres e representam a maior parte das causas de morbimortalidade dentro desse grupo. Dessa forma, é evidente que o desenvolvimento de fármacos que interrompam o processo metastático constitui grande interesse para reduzir a mortalidade e melhorar a qualidade de vida dos pacientes oncológicos.

As metaloproteinases de matriz (MMP) são uma família de endopeptidades dependentes de zinco envolvidas na degradação de matriz extracelular. As MMP participam de processos fisiológicos como a angiogênese, reparo tecidual, migração celular e embriogênese. Contudo elas exercem papel central no crescimento tumoral e em vários processos de invasão e metástases, como, alteração das interações célula-célula e célula-matriz extracelular, pela degradação de componentes de adesão, migração e angiogênese (GIALELI, 2011). Mais especificamente, as MMP-2 e MMP-9, conhecidas como gelatinases, tem como substrato o colágeno IV, amplamente presente na membrana basal dos tecidos. As MMP também têm participação nos mecanismos de neovascularização, fundamental para a sobrevivência dos tecidos tumorais. (SNOEK-VAN BEURDEN & VON DEN HOFF, 2005). Em tumores de mama, próstata e cólon reto, altos níveis de expressão de MMP-1 e MMP-2 já foram associados com tumores primários mais agressivos, bem como com maior probabilidade de sucesso de metástases (CIERNA, 2014).

As cisteíno-proteases derivadas do látex de V. cundinamarcensis, família Caricacea, planta típica do oeste da América do Sul semelhante ao mamão (Carica papaya) possuem atividade na defesa contra patógenos e no mecanismo de coagulação da planta. A separação cromatográfica do látex de V. cundinamarcensis resulta em dois picos, sendo que o primeiro (chamado de P1G10) apresenta intensa atividade proteolítica in vitro e efeitos tumorais e antimetastáticos em estudos pré-clínicos com modelos murinos de melanoma (VIANA, 2010; DITTZ, 2011). Os mecanismos observados para a ação sobre a linhagem B16F10 incluem a indução de apoptose, perda da adesão e da capacidade de invasão celular (BRAGA, 2013; DITTZ, 2015).

Assim, o presente trabalho buscou avaliar o efeito das proteases de V. cundinamarcesis sobre etapas da metástase relacionadas ao processo de invasão, por meio da determinação da atividade de metaloproteases de matriz 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9, respectivamente) em células de melanoma murino B16F10 expostas à P1G10.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. CULTIVO DAS CÉLULAS

Células da linhagem B16F10 (melanoma murino) foram mantidas em meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute Medium 1640) a 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) em frascos de cultivo em estufa de cultura a 37 °C com atmosfera úmida e 5% (v/v) de CO2 e a proliferação foi acompanhada. Ao atingirem aproximadamente 80% de confluência, subcultivos das linhagens foram realizados ampliando a cultura para ensaios biológicos. As células foram, inicialmente, lavadas com a solução de PBS 1mM, pH 7,4 e, posteriormente, adicionou-se tripsina a 0,5% (v/v) para que estas se soltassem da garrafa de cultivo. Quando as células se apresentavam completamente desprendidas, foi adicionado meio RPMI com 5% FBS para inativar a tripsina. A suspensão celular obtida, após contagem, foi ajustada à densidade celular apropriada para a realização dos experimentos.

2.2. TRATAMENTO DAS CÉLULAS

As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 e FBS à 10% (v/v). Após atingirem a confluência de aproximadamente 70-80%, o meio foi removido e substituído por meio RPMI contendo FBS 0,1%, FBS 10%, P1G10 (0,1 μg/mL ou 1 μg/mL). Após 24, 48 e 72 horas de tratamento, as células foram lavadas três vezes em PBS e foi adicionado Tampão de Lise (Tris, NaCl, Triton X-100, e inibidores de protease (Protease Inhibitor Cocktail SIGMAFAST™, contendo AEBSF, Bestatin, E-64, Pepstatina A, Fosforamidon, Leupeptina e Aprotinina) em meio livre de EDTA, por um período de 30 minutos. Então, as amostras foram centrifugadas à 14.000 G por 10 minutos à 4ºC. O sobrenadante foi retirado e congelado à -20ºC. Uma alíquota de 5 μL foi reservada de cada amostra para estimativa das concentrações proteicas.

2.3. ESTIMATIVA DAS CONCENTRAÇÕES PROTEICAS DO SOBRENADANTE

A partir do sobrenadante obtido, a determinação aproximada da concentração proteica foi realizada pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976). A partir de uma solução de albumina bovina sérica (BSA) de 1 mg/mL foram feitas diluições seriadas em água destilada nas concentrações de 10, 9, 8, 6, 4, 2, 1 e 0 μg/μL as quais foram adicionadas a 290 μL do reagente de Bradford, ajustando o volume final, com PBS, para 300 μL. Na determinação da concentração proteica das amostras, foi utilizado um volume de 5 μL do lisado celular, diluído em PBS na proporção de 1:1. Então, realizou-se a leitura espectrofotométrica à 630 nm, a partir da qual obteve-se uma curva padrão de BSA por onde estimou-se a concentração proteica das amostras.

2.4. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE PROTEOLÍTICA

Para a determinação da atividade gelatinolítica das metaloproteases 2 e 9 foi utilizado o método de zimografia, em gel de poliacrilamida, conforme descrito (ABCAM, 2021). Preparou-se o gel de poliacrilamida desnaturante à 7,5% com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) contendo 1,5% de gelatina. Então, em sistema de eletroforese (Bio-Rad®), realizou-se a pré-corrida a 120 volts por 5 minutos. Após isso, foram adicionados de 2 a 15μg de proteína do lisado celular (item 3.3) em tampão de amostra (SDS 4%, Glicerol 20%, azul de bromofenol 0,01% e Tris-HCl 125mM) em cada canaleta do gel. Finalmente, o gel foi submetido à corrida a 90 volts por um tempo médio de 120 minutos. Após a corrida, o gel foi lavado com cerca de 50 mL de tampão de lavagem (Triton X-100 2,5%, Tris-HCl 50mM, CaCl2 5mM, ZnCl2 1μM) por 30 minutos e transferido para o tampão de incubação (Triton X-100 1,0%, Tris-HCl 50mM, CaCl2 5mM, ZnCl2 1μM) onde foi lavado por mais 30 minutos, descartado e novamente adicionado para incubação por 24 horas à 38ºC. Após esse período, o gel foi adicionado à solução de coloração de Azul de Comassie (Metanol 40%, Ácido Acético 10%, Azul de Comassie 0,5%), na qual permaneceu por 30 minutos. Por fim, o gel foi descorado com solução de descoloração (Metanol 40%, Ácido Acético 10%) por 30 minutos ou até a visualização das bandas. Foram obtidas fotografias do gel as quais tiveram as intensidades das áreas não coradas, correspondente à degradação do substrato (gelatina), quantificadas através do software ImageJ®.

2.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA

As análises estatísticas foram realizadas por meio do programa Prism® versão 5.0 (GraphPad,Intuitive Software for Science, San Diego, CA). Os dados expressos como média foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Student Newman-Keulstest com nível de significância de 5% (p < 0,05).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para a estimativa da concentração proteica do lisado de B16F10 após o tratamento com P1G10, utilizou-se o método de Bradford (BRADFORD, 1976). O método de Bradford é um método colorimétrico para determinação da quantidade total de proteína que se baseia nas alterações de absorbância que o corante Azul de Comassie promove ao se ligar às proteínas. Em meio ácido, o azul de Comassie permanece em sua forma protonada, de coloração vermelha. A ligação do corante a proteínas promove sua conversão à sua forma não protonada, assumindo a coloração azul. Essa variação colorimétrica é detectada pela leitura de absorvância por espetrofotometria a fim de quantificar a concentração de proteínas. Inicialmente, foi realizada a curva padrão de BSA (1 a 10 μg/μL) para a estimativa da concentração proteica dos lisados celulares (Fig. 2). A partir das densidades ópticas (DO), determinadas a 630 nm, foi realizada uma regressão linear, obtendo-se, então, a equação da reta (Y = 0,05082X +0,6330). O coeficiente de determinação (R2) obtido foi de 0,9841, mostrando que o modelo linear explica 98,41% da variabilidade entre os pontos da curva, portanto, adequando-se para a finalidade proposta.

Fig 1. Curva Padrão de BSA. A curva padrão de BSA e a determinação da concentração proteica foram realizadas pelo método de Bradford, com leitura espectrofotométrica a 630nm.

A partir da curva padrão obtida estimou-se, então, a concentração proteica do sobrenadante dos lisados celulares após o tratamento com P1G10 0,1 ou 1 μg/mL por 24, 48 ou 72h (Tabela 1).

Tabela 1. Estimativa das concentrações proteicas nas amostras e controles

Grupos	24 horas	48 horas	72 horas
Controle FSB 0,1% (Grupo A)	0,4728	0,2873	0,2487
Controle FSB 10% (Grupo B)	0,5474	0,2125	0,5160
P1G10 1,0 µg/mL (Grupo C)	0,6770	0,4723	0,3401
P1G10 10,0 µg/mL (Grupo D)	0,5199	0,2901	0,2461

Fonte: Autores (2024)

Inicialmente, para a padronização do método, realizou-se a zimografia em gel de poliacrilamida contendo gelatina utilizando-se quantidades de P1G10 correspondente a 2, 5 10 e 15 μg/canaleta (Figura 3).

a)

b)

Fig 2. Zimografia da fração P1G10 do látex de Vasconcellea cundinamarcensis. (a) Imagem do gel, após a zimografia, contendo duas bandas principais, não coradas, correspondentes à degradação do substrato (gelatina). (b) Intensidade (unidade arbitrária) das bandas não coradas após zimografia de amostras de P1G10.

Na Fig. 2a, pode-se observar que a área de degradação do substrato (gelatina) correspondente às bandas claras na figura, de maneira dependente da quantidade de amostra. Nas canaletas contendo 15 μg de P1G10, a intensidade da degradação do substrato, evidenciada em duas bandas principais, foi superior às amostras contendo 10, 5 e 2 μg de proteína (Fig. 2b). Apesar de não ser o substrato específico para as enzimas proteolíticas contidas na fração P1G10, foi possível padronizar o método para a visualização das bandas degradadas em gel de poliacrilamida contendo gelatina.

Então, a partir do lisado celular obtido após o tratamento de B16F10 com P1G10 0,1 ou 1 μg/mL por 24, 48 ou 72h, realizou-se a zimografia em gel de poliacrilamida contendo gelatina para a determinação da atividade gelatinolítica de metaloproteases intracelulares (Fig. 3).

a)

b)

Fig 3. Zimografia do sobrenadante das células B16F10 na presença ou não de P1G10 em diferentes concentrações. (a) Imagem do gel, após a zimografia, contendo duas bandas principais, não coradas, correspondentes à degradação do substrato (gelatina). (b) Intensidade (unidade arbitrária) das bandas não coradas após zimografia do lisado de células B16F10 tratadas com FBS (0,1 ou 10%) ou P1G10 (0,1 ou 1 µg/mL) por 24, 48 e 72h.

A Fig. 3a mostra que o tratamento com P1G10 1 ou 0,1 μg/mL (grupos C e D, respectivamente) diminuiu a degradação da gelatina contida no gel, em todos os tempos analisados, quando comparado aos grupos controles (FBS 0,1 e 10%), evidenciado pela redução da área não corada. Por sua vez, também houve redução da degradação de gelatina nos grupos tratados com FBS 0,1 ou 10%, a partir de 48h de tratamento. Ao quantificar a intensidade da área (em unidades arbitrárias), verificou-se que P1G10 1 μg/mL reduziu em, aproximadamente, 60% a atividade gelatinolítica após 24h de tratamento, em 75% após 48h, quando comparadas ao grupo controle (FBS 0,1%). Após 72h, nas mesmas condições, houve ligeiro aumento da atividade gelatinolítica de P1G10 1 μg/mL, comparado ao seu respectivo controle. Nas células tratadas com P1G10 0,1 μg/mL, houve redução aproximada de 70%, 10% e 10%, após 24, 48 e 72h de tratamento, respectivamente (Fig. 3b).

As MMP são um grupo de enzimas de remodelação da matriz extracelular, caracterizadas por sua capacidade de degradar proteínas da matriz extracelular e estudadas extensivamente pelo seu papel na invasão tumoral, neoangiogênese e metástase. A MMP-9 já foi apontada como tendo papel importante no câncer gástrico, além de altos níveis associados com pior prognóstico no câncer de mama (BJORKLUND, 2006). Além disso, a associação entre a integrina αvβ6 na mediação da secreção de MMP-9 mostrou-se como essencial na progressão de câncer colorretal e na piora das taxas de sobrevida nesse tipo de carcinoma (BJORKLUND, 2006). A MMP-9 também foi descrita como tendo papel na indução de fator de crescimento do endotélio vascular em metástases de pulmão, e, portanto, a redução dos níveis dessa metaloprotease poderia ajudar na redução de metástases. Por fim, a MMP-9 também teve seu papel descrito em diversas neoplasias associadas com inflamação, especialmente por conta da diminuição da resposta imune ao câncer devido à clivagem da interleucina 2α e na liberação da molécula de adesão celular intercelular e na ativação do fator transformador de crescimento (BJORKLUND, 2006; TEIXEIRA, 2008).

Considerando que as metaloproteases 2 e 9 possuem peso molecular de 64kDa e 86kDa, respectivamente (BENCSIK, 2017), espera-se que, em uma corrida eletroforética em gel de acrilamida (SDS-PAGE), a posição da MMP-9 seja superior à da MMP-2. Por esse motivo, infere-se que, no protocolo realizado, foi possível verificar a atividade gelatinolítica da MMP 9. Nosso trabalho mostrou a diminuição da atividade da MMP-9 em linhagem de melanoma B16F10, localizada intracelularemente, quando tratadas com P1G10 nas concentrações de 1,0 e 0,1 μg/mL, especialmente após 48 horas de tratamento.

Trabalhos anteriores mostraram que o tratamento com P1G10 30 μg/mL, por 24h, promove uma redução da atividade de MMP2 e MMP2 presentes no sobrenadante de culturas celulares (DITTZ, 2015). Trabalhos que avaliaram o efeito anti-inflamatório da P1G10 sobre colite induzida em ratos, mostraram que 0,3 mg/kg de P1G10, por via oral, diminui a atividade de MMP-2 presente no tecido lesionado em 23% em relação ao grupo de ratos com colite induzida. Tendência semelhante foi observada com a MMP-9, mas sem significância estatística (ALBUQUERQUE, 2020). Outros estudos mostraram que P1G10 reduziu a atividade de MMP-9 em aproximadamente 70% na pele de camundongos submetidos a um modelo de feridas geradas por excisão cutânea (FREITAS, 2017). P1G10 0,1% e 1% também foi capaz de reduzir a quantidade de MMP-9 à níveis basais, quando usados em lesões induzidas por UVB em camundongos, contribuindo para a inibição da degradação de colágeno induzida por UVB (FREITAS, 2019).

Dessa maneira, observa-se que as metaloproteases desempenham um papel crucial no processo metastático, contribuindo para a progressão e disseminação de células tumorais. Essas enzimas, degradam componentes da matriz extracelular, como colágeno e elastina, permitindo que as células cancerígenas invadam tecidos adjacentes e entrem na circulação sanguínea ou linfática. Além disso, as MMP modulam a interação das células tumorais com o microambiente, liberando fatores de crescimento e citocinas que promovem a angiogênese e a sobrevivência celular. O desequilíbrio na regulação das metaloproteases é um dos principais fatores que favorecem a agressividade tumoral, tornando essas enzimas alvos potenciais para terapias antimetastáticas (TEIXEIRA, 2008).

4. CONCLUSÃO

A redução da atividade de MMP9 intracelular, promovida por P1G10 em células de melanoma B16F10, pode contribuir para o efeito antimetastático dessa fração proteolítica, já descrita em modelo murino de melanoma. Assim, os estudos subsequentes visando elucidar o mecanismo de ação, segurança e eficácia dessa fração podem fornecer subsídios para uma nova alternativa terapêutica para o tratamento de tumores metastáticos. 

5. REFERÊNCIAS

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Como citar esse artigo:

MOURA, Matheus Henrique de Sousa; DITTZ JÚNIOR, Dalton. Ação de metaloproteases em melanoma B16F10 exposto à fração P1G10 de Vasconcellea Cundinamarcensis. Revista QUALYACADEMICS. Editora UNISV; v.2, n.6, 2024; p. 299-311. ISSN 2965976-0 | D.O.I.: doi.org/10.59283/unisv.v2n6.022

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Artigo 22 -AÇÃO DE METALOPROTEASES EM MELANOMA B16F10 EXPOSTO À FRAÇÃO P1G10 DE VASCONCELL

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